Uprawa Bacillus choroby Whipplea cd

Jedną z fiolek z muszlą używano do badania czasu generowania. Komórki zebrano pozostałym supernatantem i ponownie zawieszono w świeżej pożywce w celu uzyskania 10 ml zawiesiny komórek, którą podzielono na pięć próbek o objętości 2 ml. Komórki jednej porcji poddano lizie w czterech cyklach zamrażania i rozmrażania w ciekłym azocie i gorącej wodzie (55 ° C) i inokulowano na konfluentne monowarstwy komórek w kolbie do hodowli komórkowej o pojemności 25 cm2 (kolba C) z 5 ml pożywki . Dwie porcje inokulowano na konfluentną monowarstwę komórek w dwóch 25-cm2 kolbach do hodowli komórkowej (kolby B i D) z 5 ml pożywki. W 85 dniu pożywkę we wszystkich kolbach i fiolkach z otoczką zastąpiono świeżą pożywką. Komórki w kolbie D zebrano i zaszczepiono do wolnej od komórek 75-cm2 kolby do hodowli komórkowej (kolba D2) z 15 ml pożywki. Przed wymianą pożywki otrzymano 200 .l każdego supernatantu w celu odwirowania cytologicznego i barwienia PAS. W dniach 95 i 105 pożywka we wszystkich butelkach i fiolkach z muszli została ponownie wymieniona. Małe porcje monowarstw komórkowych zdrapano w celu otrzymania wymazów komórkowych do barwienia PAS. Skuteczność propagacji oceniano na podstawie półilościowych zliczeń tych rozmazów komórkowych. Każdy rozmaz analizowano mikroskopowo przy powiększeniu 1000 dla prątków PAS-dodatnich. Wynik 0 został przypisany, jeśli nie znaleziono pałeczek pozytywnych pod względem PAS; wynik + oznaczał obecność prątków, ale trudne do znalezienia, wynik ++ wskazuje, że prątki były łatwo wykrywane, ale nie były obecne we wszystkich dziedzinach, a wynik +++ wskazywał, że prątki były obecne we wszystkich dziedzinach. Wszystkie smugi zostały ocenzurowane przez dwóch badaczy. Aby zapewnić ciągłą produkcję izolatu, gdy tylko kolba otrzymała wynik +++, komórki zebrano i zaszczepiono do trzech kolb do hodowli komórkowych o objętości 150 cm2 bez komórek, przy objętości dostosowanej do 35 ml przez dodatek świeżej pożywki. Próbowaliśmy również rozmnażać izolat przez zaszczepienie komórek na monowarstwach komórek MRC 5 hodowanych w ten sam sposób, co komórki HEL i w ośrodku aksjalnym (agar czekoladowy i agarze z krwi owczej Columbia, BioMérieux, Marcy l Etoile, Francja) i inkubowano w temperaturze 32 ° i 37 ° C w obecności 5% dwutlenku węgla oraz w warunkach mikroaerofilowych i beztlenowych. Inkubowaliśmy również izolaty z samą pożywką do hodowli komórkowej i pożywką do hodowli komórkowej zawierającą lizat komórek HEL w temperaturze 32 ° i 37 ° C w obecności 5% dwutlenku węgla. Transmisyjna mikroskopia elektronowa
W 105 dniu, około 1000 zainfekowanych komórek z kolby drugiego przejścia przygotowano do badania za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (model 1220, Jeol, Croissy sur Seine, Francja), jak opisano wcześniej18.
Barwienie immunofluorescencyjne
W 105 dniu monowarstwę z jednej fiolki z muszlą badano przez bezpośrednią immunofluorescencję, jak opisano wcześniej, 16,19 z użyciem surowicy pacjenta jako pierwszorzędowego przeciwciała. Nakrywki badano za pomocą skaningowego mikroskopu fluorescencyjnego (model DMIRBE, Leica, Wetzlar, Niemcy) wyposażonego w soczewkę immersyjną (100 x). Aby ocenić nasze metody serologiczne, przeanalizowaliśmy również dziewięć próbek surowicy od pacjentów z potwierdzoną chorobą Whipple a
[hasła pokrewne: nerw bloczkowy, niedociśnienie ortostatyczne, nerw strzałkowy powierzchowny ]
[więcej w: olx knurów, uj cm, patofizjologia cmuj ]