Uprawa Bacillus choroby Whipplea czesc 4

Próbka surowicy od naszego pacjenta, jedna od pacjenta z zapaleniem wsierdzia z powodu choroby Whipple a, jak wykazano w badaniu PCR, 20 i 7 od pacjentów z histologicznie udowodnioną chorobą Whipple a (w dwóch z nich DNA Tropheryma whippelii wykryto w tkance dwunastniczej za pomocą testu PCR) zostały przetestowane. Grupa siedmiu pacjentów została uznana za klasyczną chorobę Whipple a, aby odróżnić ich od dwóch pacjentów z zapaleniem wsierdzia z powodu choroby Whipple a. Czterdzieści jeden próbek surowicy zastosowano jako kontrole negatywne: 11 uzyskano od pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi, 10 uzyskano od pacjentów z zapaleniem wsierdzia z powodu Coxiella burnetii (5 pacjentów) i Bartonella quintana i B. henselae (5 pacjentów) i 20 zostały uzyskane od zdrowych dawców krwi. Opracowaliśmy procedurę, która wykorzystuje ośmiokierunkowe slajdy komorowe Lab-Tek (Nunc, Naperville, IL.) I umożliwia przygotowanie 12 preparatów na raz. Supernatant usunięto z 150-cm2 kolby do hodowli komórkowej zawierającej około 10 000 komórek HEL i w której infekcja była obecna na wszystkich polach (+++) przez liczbę półilościową. Cztery mililitry 0,25% trypsyny (GIBCO, Grand Island, NY) dodano do monowarstwy komórek i hodowlę inkubowano w 37 ° C przez około 10 minut, aż komórki oddzieliły się od dna kolby. Komórki następnie ponownie zawieszono w 35 ml świeżej pożywki i 350 .l zawiesiny dodano do każdej studzienki na szkiełkach komory Lab-Tek. Szkiełka inkubowano przez 12 godzin w 37 ° C w obecności 5% dwutlenku węgla, tak że komórki mogły przylgnąć do szkiełka. Próbki surowicy rozcieńczono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (1:25, 1:50 i 1: 100), która zawierała 3 procent beztłuszczowego mleka w proszku i oznaczono miana IgG i IgM. W przypadku pacjentów z mianem IgM wynoszącym 1:25 próbki surowicy rozcieńczano od 1:50 do 1: 400. Aby usunąć IgG, adsorbent czynnika reumatoidalnego (pochłaniający RF, Behringwerke, Marburg, Niemcy) dodano przed oznaczeniem IgM, zgodnie z instrukcjami producenta. Pożywkę hodowlaną usunięto, komórki utrwalono metanolem, a następnie studzienki przemyto dwukrotnie solanką buforowaną fosforanem. Następnie do studzienek dodano 100 .l próbek każdego rozcieńczenia surowicy, a szkiełka komorowe inkubowano w wilgotnej komorze w 37 ° C przez 30 minut. Szkiełka przemywano trzy razy solanką buforowaną fosforanem, a następnie inkubowano przez 30 minut w 37 ° C z 100 .l koziej przeciwludzkiej IgG (Fluoline G, BioMérieux) lub IgM (Fluoline M, BioMérieux) w rozcieńczeniu 1: 300 w sól fizjologiczna buforowana fosforanem. Szkiełka została przemyta trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanem, plastikowe wierzchnie struktury zamontowane na szkiełkach zostały usunięte, a szkiełka zamontowane w podłożu glicerynowym buforowanym fosforanem (pH 8) i zbadane przy powiększeniu 400 mikroskopem epifluorescencyjnym ( Zeiss, Thornwood, NY).
Wytwarzanie i charakteryzowanie mysich przeciwciał poliklonalnych
Immunokompetentne myszy BALB / c, które były w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, zaszczepiono podskórnie 0,5 ml roztworu zawierającego 106 bakterii uzyskanych z supernatantu zainfekowanych komórek zmieszanych z 0,5 ml kompletnego adiuwanta Freunda.
[podobne: nerw bloczkowy, idiosynkrazja, szmery oddechowe ]
[hasła pokrewne: babka plesznik, gratka yorki, babka płesznik opinie ]